Методика подсчета эритроцитов в камере Горяева

Методика подсчета эритроцитов в камере Горяева

Устройство камеры и сетки Горяева. Камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, прорезанное четырьмя поперечными бороздами. Борозды делят стекло на пластинки — две боковые и среднюю. Средняя пластинка на 0,1 мм ниже боковых. Она разделена поперечной бороздкой на 2 равные части. На каждой половине средней пластинки нанесена сетка Горяева. Принадлежностью’ камеры служит шлифованное покровное стекло. Его следует наложить так, чтобы оно покрыло обе боковые и среднюю пластинки. Нажимая большими пальцами на края стекла, его притирают к боковым пластинкам до появления радужных колец (кольца Ньютона).

Так как боковые пластинки выше средней, между нею и покровным стеклом остается щель. Это и есть камера, в которую заливают разведенную кровь. Глубина камеры 0,1 мм.

Нанесенная на дно камеры сетка Горяева квадратная. Сторона ее — 3 мм, площадь-—9 мм». Сетка разграфлена на 225 больших квадратов—15 по горизонтали и 15 по вертикали. Часть больших квадратов (через два на третий) разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадра­та равна 1/20 мм .

Техника подсчета. Правильное заполнение счетной камеры разведенной кровью обеспечивает точность под­счета форменных элементов. Перед заполнением камеры содержимое пробирки перемешивают, вращая ее между ладонями в течение 2 мин. Разведенную кровь наносят на среднюю пластинку камеры пастеровской пипеткой с баллоном или стеклянной палочкой, помещая ее около края покровного стекла. По закону капиллярности жид­кость затекает под стекло, заполняя камеру.

После заполнения камеру нужно положить на стол на 2—3 мин, пока движение жидкости в ней не прекратится, и клетки не расположатся неподвижно на фоне квадратов сетки. При заполнении камеры жидкость не должна стекать в борозды. Недопустимо попадание в камеру пузырьков воздуха.

Подсчет производят под малым» увеличением микро­скопа (об.8, ок.10 или 15), конденсор должен быть опущен, а диафрагма закрыта.

Возможные ошибки при подсчете:

Правила:

-к данному квадрату принадле­жат клетки, находящиеся большей своей половиной внут­ри него;

— клетки, разделенные пограничной линией попо­лам, считают только на верхней и левой границе квадрата;

— клетки же, лежащие большей своей половиной вне данно­го квадрата не считают вовсе.

Принцип. Подсчет эритроци­тов под микроскопом в определенном количе­стве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл крови, исходя из объема квадратов и разведе­ния крови.

Реактивы. 0,9 % раствор хлорида натрия

Специальное оборудование. 1. Счетная камера Горяева. 2. Микроскоп.

Ход исследования. Разводят иссле­дуемую кровь в 200 раз. Для этого в сухую про­бирку отмеривают 4 мл реактива 1 или 2. Пипет­кой набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вы­тирают фильтровальной бумагой или марлей, и кровь выдувают на дно пробирки; пипетку тща­тельно промывают в верхнем слое жидкости, повторно набирая ее и выдувая в пробирку, содержимое пробирки перемешивают и остав­ляют стоять до момента счета (рекомендуется считать эритроциты в ближайшие 2—3 ч после взятия крови, а при гемолитических и. В 12-дефи­цитных анемиях — сразу после взятия, так как эритроциты могут разрушиться). Недопустимо оставлять взятую кровь с несосчитанными эри­троцитами на следующий день, так как эритро­циты частично разрушаются.

Подготавливают счетную камеру: протирают насухо камеру с сеткой и покровное стекло, за­тем покровное стекло притирают к камере, слегка надавливая на стекло таким образом, чтобы по краям его появились радужные полосы (это сви­детельствует о требуемой высоте камеры — 0,1 мм).

Заполняют счетную камеру разведенной кровью: предварительно несколько раз тщатель­но встряхивают содержимое пробирки, затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха запол­нила всю поверхность камеры с сеткой, не зате­кая в бороздки. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении 1 мин (ДЛЯ ОСЕДАНИЯ эритроцитов).

Для подсчета эритроцитов — микроскоп (объектив на 8х, окуляр на 10Х), находят верхний левый край сетки. Счет производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах.

Расчет количества эритроцитов:

производится по следующей формуле:

Х= а ■ 4000 ■ в

б

где X — количество форменных элементов в 1 мкл крови;

а — количество формен­ных элементов, сосчитанных в 80 малых квадратов;

б— количество сосчитанных малых квадратов;

в — степень разведения крови; 1\4000 мкл — объем малого квадрата; умножая на 4000, приводим к объему 1 мкл крови.

Сокращенная формула: Х= а х10000

Нормативные показатели:

У мужчин: 4,0-5,0 х 10 12

У женщин: 3,7-4,7 х 10 12

Клинико-диагностическое значение: Снижение числа эритроцитов в крови является одним из ос­новных лабораторных критериев анемии. Однако степень эритроцитопении широко варьирует при разных формах малокровия. Так, при наиболее распространенном заболевании — железодефицитной анемии на почве хронических кровопотерь — количество эритроцитов может быть нор­мальным или нерезко сниженным (3• 106 — 3,6-106 в 1 мкл, или 3-10’2/л — 3,6-10|2/л). При острой кровопотере, В|2

-дефицитной анемии (в стадии рецидива), гипопластической анемии, гемолитических анемиях (в период криза) число эритроцитов в крови может значительно сни­зиться и достигнуть I -106 в 1 мкл, или 1 • 10|2/л и менее.

Повышение количества эритроцитов в кро­ви — эритроцитоз — может быть обусловлен многими причинами. Значительный эритроцитоз (6,5-106—8,5-10е в 1 мкл, или 6,5-10|2/л — 8,5-10|2/л крови) является одним из важных лабораторных симптомов эритремии. Другие гемобластозы миелопролиферативной природы (сублейкемический миелоз или миелофиброз и хронический миелолейкоз) реже сопровождают­ся эритроцитозом и только в начальной стадии заболевания.

Вторичный(симптоматический) эритроцитоз может сопутствовать широкому кругу различ­ных заболеваний и бывает абсолютным (связан­ный с усилением нормального эритропоэза) и от­носительным (гемоконцентрационный). Абсо­лютные эритроцитозы сопутствуют хроническим обструктивным заболеваниям легких, врожден­ным порокам сердца, первичной легочной гипертензии, синдрому Пиквика, наследственным гемоглобинопатиям, гипернефроидному раку, гемангиобластоме мозжечка, гепатоме, гормо­нально-активным опухолям, заболеваниям, со­провождающимся стенозом почечных артерий, заболеваниям ЦНС и др. Вторичные относитель­ные эритроцитозы связаны с нарушением гемо-концентрации и характеризуются нормальным объемом циркулирующих эритроцитов при сни­жении массы циркулирующей крови и массы циркулирующей плазме.

Патологические формы эритроцитов

Повышение числа эритроцитов — полицитемия, мо­жет быть истинной (опухолево-пролиферативный процесс) и симптоматической (реактивное раздражение эритропоэза, сгущение крови, нарушение нервной регуляции и пе­рераспределения). Понижение числа эритроцитов — ане­мия (постгеморрагическая, гемолитическая, вследствие нарушения кроветворения).

Качественные изменения эритроцитов

. Анизоцитоз — изменение величины эритроцитов (эритроциты меньших размеров называются микроцитами; больших — макроцитами, эритроциты диаметром 12 мкм и более называются мегалоцитами). Пойкилоцитоз — изменение формы эритроцитов (грушевидные, серповидные — дрепаноциты, каплевидные, мишеневидные, с вытянутыми концами, шизоциты — обломки разрушенных эритроци­тов, акантоциты — эритроциты зубчатой формы, стоматоциты — эритроциты с просветлением в центре в виде узкой линейной полоски как форма рта, эхиноциты — эритроциты с множественными выростами, анулоциты — эритроциты в виде пустых колец). Анизохромия — из­менение интенсивности окраски эритроцитов в патологи­ческих случаях. Встречаются бледно окрашенные эрит­роциты — гипохромия, интенсивно окрашенные — гиперхромия. Эритроциты могут окрашиваться не только кислыми, но и основными красителями — полихромазия.

Обнаруживаются при патологии в периферической кро­ви ядросодержащие эритроциты: нормобласты, эритро­бласты и мегалобласты. Мегалоциты и мегалобласты ха­рактерны для анемии Аддисона-Бирмера.

В эритроцитах можно иногда обнаружить остатки ядерной оболочки — так называемые кольца Кебота и ядерные остат­ки — тельца Жолли при мегалобластных анемиях, отравле­нии гемолитическими ядами и др. При свинцовом отравлении и у людей, принимающих препа­раты крови, наблюдается базофильная пунктуация эритроци­тов (наличие точечной зернисто­сти). Сидероциты — эритроциты с включениями не гемоглобинового железа (ферритин, гемосидерин) в виде мелких гранул синего цвета.

2.5 Подсчет лейкоцитов

ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ЭРИТРОЦИТОВ.

В крови содержится в среднем 4,5-5 х 1012/л (в 1 мкл — 1 мм3 крови обычно содержится эритроцитов у мужчин 4500000—5000000, у женщин: 4000000—4500000.

Для подсчета форменных элементов кровь, взятую из пальца, разбавляют в специальных смесителях (меланжерах), чтобы создать нужную концентрацию клеток, удобную для подсчета. Для подсчета числа эритроцитов пользуются счетной камерой. Каков бы ни был внешний вид камеры, принцип ее устройства один и тот же. На предметном стекле в углублении высотой 0,1мм расположена сетка. В камере Горяева (рис.а), кото­рой чаще всего пользуются, сетка состоит из 225 больших квад­ратов. Из них 25 квадратов дополнительно разделены на 16 ма­леньких. Каждый разделенный квадрат со всех сторон окружен неразделенными, что облегчает счет (рис.б).

Для подсчета форменных элементов кровь разбавляют чтобы создать нужную концентрацию клеток, удобную для подсчета. Для разбавления крови при подсчете эритроцитов применяют 3% гипертонический раствор хлорида натрия, в котором эритроциты сморщиваются.

Ход работы:

1. Перед началом работы необходимо разобраться в устройстве сетки счетной камеры. Для этого помещают камеру под микроскопом и сначала на малом, а затем под большим увеличением рассматривают сетку, находят малые квадратики и большие квадраты.

2. В предварительно высушенную чистую коническую пробирку точно отмеривают 4 мл физиологического раствора и осторожно выдувают в нее 0,02 мл капиллярной крови (кровь набирают в капилляр из гемометра Сали). Получается разведение 1:200. Взвесь тщательно перемешивают (пробирочный способ Н.М.Николаева).

3.Выпустив предварительно наружу 1-2 капли, наносят капельку на сетку камеры, предварительно путем притирания плотно закрытую покровным стёклышком. На предметное стекло в том месте, где на нем расположена сетка, поместите покровное стекло и тщательно прижмите его большими пальцами рук (рис. 3). До появления ньютоновых колец – окрашенных в цвет радуги полосок. Одну треть содержимого смесителя выпустите на ватку, а следующую каплю вы­дуйте на предметное стекло подпокровное. Поместите предметное стекло на столик микроскопа, найдите при малом увеличении сетку. Затем, установив большое увеличение, произведите подсчет. Считать эритроциты удобнее при большом увеличении (окуляр х 7, объектив х 40).

Несмотря на перемешивание, эритроциты не совсем равно­мерно распределяются в поле зрения. В этом можно убедиться, если подсчитать количество эритроцитов в нескольких соседних малых квадратах. Чтобы быть уверенным в точности подсчета, обычно эритроциты сосчитывают в 80 малых квадратах (5 больших квадратов, расположенных в разных местах сетки, например по диагонали). Рекомендуется вначале на листе бумаги нарисовать пять больших квадратов, разделить их на 16 маленьких и в каждый маленький квадратик вписать найденное число эритроцитов. Во избежание двухкратного подсчета клеток, лежащих на границах между маленькими квадратиками, руководствуются правилом Егорова: «Относящимся к данному квадратику являются эритроциты, лежащие внутри квадратика, так и на его левой и верхней границе. Эритроциты, лежащие на правой и нижней границе в данном квадратике, не считаются».

Подсчитав т.о. число эритроцитов (А) в 5 больших квадратах (что составляет 80 маленьких), находят среднее арифметическое число эритроцитов в одном маленьком квадратике А/80. Сторона одного малого квадрата равна 1/20 мм,

следовательно, его площадь 1/400 мм2. Глубина камеры—0,1
мм,
отсюда объем пространства над одним ма­лым квадратом составит 1/400·1/10=1/4000 мм3.Если в объеме над 80 ма­лыми квадратами найде­но А эритроцитов, то на один малый квадрат при­ходится А/80. Это в объеме 1/4000 мм3, Зная, что объем части камеры под одним маленьким квадратиком равен 1/4000 мм3, умножают найденное число на 4000. Получается число эритроцитов в 1 мкл разведенной крови. Умножив на разведение – 200, получают количество эритроцитов в 1 мкл цельной крови. Т.о., формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

где Х — искомое число эритроцитов,

А — число эритроцитов в 80 маленьких квадратиках.